Информация по продукту: Glu I


Название
Glu I
Кат. номераE519E520
Фасовки, е.а.50250
Концентрация, е.а./мл10001000
Цена, руб613624544

Сайт узнавания
G(5mC)↑NG(5mC)
(5mC)GN↓(5mC)G
ИсточникGlacial ice bacterium GL24
Субстратная специфичностьФермент расщепляет только C5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].


Оптимальный субстрат (активность 100%):
5'-G(5mC)↑NG(5mC)-3'/3'-(5mC)GN↓(5mC)G-5`
Субстрат для определения активностиСубстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и один канонический сайт:
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5` [2].
Единица активностиЗа одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`
в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 4-6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCNGC-3`/3`-CGNCG-5`, имеющим три 5-метилцитозина.
Определение активности GluI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2: 0 мкл Glu I
3: 0.5 мкл Glu I
4: 1 мкл Glu I
5: 2 мкл Glu I


Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.

Оптимальный SE-буферY (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
BGOWYRose
75 - 10075 - 10025 - 5050 - 75100100
Реакционный буферSE-буфер Y, (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
37oC
Условия хранения10 mM KH2PO4 (pH 7.45); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке
Неспецифический гидролизНе наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Glu I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированиюФермент расщепляет только C5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
Инактивация 20 мин при
80oC
ПримечаниеС ферментом поставляется 10 Х SE-буфер Y.
Литература:1. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Штамм бактерий Glacial ice bacterium - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Glu I.// Патент на изобретение RU 2322492 С1 (2006)
2.
 В.А. Чернухин, Е.В. Чмуж, Ю.Э. Томилова, Т.Н. Наякшина, Д.А. Гончар, В.С. Дедков, С.Х. Дегтярев Новая сайт-специфическая эндонуклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)^NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN^(5mC)G-5’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, Т. 3, №2, с. 13-17

Применение:
 В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.
Kravets AP, Mousseau TA, Litvinchuk AV, Ostermiller Sh, Vengen GS, Grodzinski DM. Changes in wheat DNA methylation pattern after chronic seed gamma-irradiation.// Tsitol Genet. 2010 Sep-Oct;44(5):18-22. Russian.