Информация по продукту: Bls I


Название
Bls I
Кат. номераE533E534
Фасовки, е.а.100500
Концентрация, е.а./мл50005000
Цена, руб613624544

Сайт узнавания
Последовательность ДНК, содержащая не менее двух 5mC:
PuPyN↑PuPy
PyPu↓NPyPu
Источник Bacillus simplex 23
Субстратная специфичностьФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].


BlsI расщепляет последовательность ДНК
5`- PuPyNPuPy-3`/3`-PyPuNPyPu-5',
содержащую не менее двух 5-метилцитозинов (N не учитывается).

Активность фермента зависит от количества и положения метилированных цитозинов.

Оптимальный субстрат (активность 100%)
  5`-G(5mC)NGC-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`

Субстрат для определения активностиСубстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три канонических сайта:
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`[2, 3].
Единица активностиЗа одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза, как минимум, одного сайта
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`
в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4).
Определение активности BlsI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2: 0 мкл Bls I
3: 0.5 мкл Bls I (1/5)
4: 1 мкл Bls I (1/5)
5: 2 мкл Bls I (1/5)
6: 1 мкл неразбавленного фермента Bls I

Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.

Оптимальный SE-буферW (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.)
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
BGOWYRose
10 - 2510 - 2550 - 7510075 - 10050
Реакционный буферSE-буфер W, (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
30oC
Условия хранения10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол;200 μg/ml BSA; 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке
Неспецифический гидролизНе наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 5 ед фермента Bls I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированиюФермент расщепляет только метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
Инактивация 20 мин при
65oC
ПримечаниеС ферментом поставляется 10 Х SE-буфер W.
Литература:1. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Штамм бактерий Bacillus simplex - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Bls I.// Патент на изобретение RU 2322494 С1 (2006)
2. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Охапкина С.С., Гончар Д.А., Дедков В.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология, т.41, №1, с. 43-50 (2007)
3.
 В.А. Чернухин, Ю.Э. Томилова, Е.В. Чмуж, О.О. Соколова, В.С. Дедков, С.Х. Дегтярев Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательность ДНК 5’-G(5mC)N^GC-3’ и расщепляет ее с образованием 3’-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, т. 3, №1, с. 28-33
4. Чернухин В.А., Гончар Д.А., Томилова Ю.Э., Болтенгаген А.А., Голикова Л.Н., Дегтрев С. Х. Метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза BlsI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5` -RYNRY- 3` при наличии в ней не менее двух 5-метилцитозинов.// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 2 ,с. 30-38 (2013).

Применение:
 В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.
 Д.А. Гончар, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2010. – Т. 6 – № 1 – С. 5-12
 А.Г. Акишев, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 5 - 16