Информация по продукту: Gla I


Название
Gla IНовая фасовка  Не расщепляет последовательность G(4mC)G(4mC)  
Кат. номераE493E494
Фасовки, е.а.100500
Концентрация, е.а./мл1000010000
Цена, руб613628961.92

Сайт узнавания
Pu(5mC)↑GPy
PyG↓(5mC)Pu
ИсточникGlacial ice bacterium GL29
Субстратная специфичностьФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет ДНК, содержащую N4-метилцитозин
[1].

Активность фермента зависит от количества и положения метилированных нуклеотидов в сайте узнавания [4].

Оптимальный субстрат (активность 100%)
          5`-G(5mC)G(mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5`
Хорошие субстраты (активность > 25%)
          5`-R(5mC)G(5mC)-3`/3`-YG(5mC)G-5`
          5`-A(5mC)GT-3`/3`-TG(5mC)A-5`
Средние субстраты (активность > 6%)
          5`-G(5mC)R(5mC)-3`/3`-(5mC)GYG-5`
          5`-G(5mC)GT-3`/3`-CG(5mC)A-5`
Плохие субстраты (активность 6%)
          5`-G(5mC)GC-3`/3`-CG(5mC)G-5`
Субстрат для определения активности Субстрат pHspAI2/GsaI представляет собой ДНК плазмиды pHspAI2, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции GsaI. Плазмида pHspAI2 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Haemophilus species A1, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.HspAI, и единственный канонический сайт узнавания GlaI
5`-G(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5` [2].
Единица активностиЗа одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта
5`-G(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5`
в 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI2/GsaI за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pHspAI2/GsaI и образование двух основных (3,419 и 699 п.н.) фрагментов ДНК (см. рисунок ниже, дор. 3-5). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCGC-3`/3`-CGCG-5`, имеющим три и два 5-метилцитозина.
Определение активности GlaI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pHspAI2/GsaI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
2 - Контрольная ДНК pHspAI2/GsaI,
3 - 0.5 мкл GlaI (разб. 1/20),
4 - 1 мкл GlaI (разб. 1/20),
5 - 2 мкл GlaI (разб. 1/20),
6 - 1 мкл неразбавленного фермента GlaI,
1 и 7- 1 Kb SE ДНК-маркеры.

Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.

Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.
Определение активности GlaI на ДНК pHspAI2/GsaI
Оптимальный SE-буферY (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
BGOWYRose
75 - 10075 - 10025 - 5025 - 50100100
Реакционный буферSE-буфер Y, (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
30oC
Условия хранения10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол;0,05% Triton X-100, 50% глицерин, 100 мкг/мл BSA. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке
Неспецифический гидролизНе наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 8 ед фермента Gla I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированиюФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет ДНК, содержащую N4-метилцитозин [1].
Инактивация 20 мин при
65oC
ПримечаниеС ферментом поставляется 10 Х SE-буфер Y.
Литература:1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Мезенцева Н.В., Томилова Ю.Э., Дегтярев С.Х., Дедков В.С. Штамм бактерий Glacial ice bacterium I - продуцент эндонуклеазы рестрикции Gla I.//Патент на изобретение RU 2287012 С1 (2006)
2.
 Чернухин В.А. , Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5’-G(5mC)^GC-3’. // Биотехнология, 2006, № 4, С.31-35
3.  Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Дегтярев С.Х. Зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов в узнаваемой последовательности 5’-GCGC-3’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, 2006, т.2, №1, с. 30-39.
4.  Тарасова Г.В., Наякшина Т.Н., Дегтярев С.Х. Субстратная специфичность новой ДНК-эндонуклеазы GlaI // BMC Molecular Biology 2008, 9:7 - на английском языке
5. Землянская Е. В., Дегтярев С. Х. Субстратная специфичность и свойства метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз.// Молекулярная биология, том 47, № 6, с. 900–913(2013)

Применение:
 В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.
Абдурашитов М.А., Чернухин В.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. GlaI digestion of mouse γ-satellite DNA: study of primary structure and ACGT sites methylation // BMC Genomics 2009, 10:322. - на английском языке
 Д.А. Гончар, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2010. – Т. 6 – № 1 – С. 5-12
Wood, R. J., McKelvie, J. C., Maynard-Smith, M. D., and Roach, P. L. A real-time assay for CpG-specific cytosine-C5 methyltransferase activity.// (2010) Nucleic Acids Res 38, e107
 А.Г. Акишев, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 5 - 16
Kravets AP, Mousseau TA, Litvinchuk AV, Ostermiller Sh, Vengen GS, Grodzinski DM. Changes in wheat DNA methylation pattern after chronic seed gamma-irradiation.// Tsitol Genet. 2010 Sep-Oct;44(5):18-22. Russian.
F. Syeda, R.L. Fagan, M. Wean, G.V. Awakumov, J.R. Walker, S. Xue, S. Dhe-Paganon, & C. Brenner, "The RFTS Domain is a DNA-competitive Inhibitor of Dnmt1"//, JBC, v. 286, pp. 15344-15351 (2011).
Keith N. Rand, Graeme P. Young, Thu Ho and Peter L. Molloy , "Sensitive and selective amplification of methylated DNA sequences using helper-dependent chain reaction in combination with a methylationdependent restriction enzymes."//, Nucleic Acids Research, pp. 1-10 (2012).
Fagan RL, Wu M, Chedin F, Brenner C An Ultrasensitive High Throughput Screen for DNA Methyltransferase 1-Targeted Molecular Probes //PLoS ONE 8(11): e78752. doi:10.1371/journal.pone.0078752 (2013) - на английском языке
Кузнецов В.В., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК.// Патент на изобретение RU 2525710 С1 (2014)