Информация по продукту: Щелочная фосфатаза |
Название | Щелочная фосфатаза | Кат. номера | E328 | Фасовки, е.а. | 500 | Концентрация, е.а./мл | 20000 |
Цена, руб | 8700 |
Источник | Выделена из кишечника теленка | Описание | Щелочная фосфатаза из кишечника телёнка (англ. CIP) катализирует
дефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.
| Единица активности | За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 1 мл реакционной смеси за 1 мин при 37°C.
Реакционная смесь содержала 1M диэтаноламин-HCl (pH 9.8 при 25°C), 0,5 mM MgCl2,10 mM пара-нитрофенилфосфат.
| Реакционный буфер | SE-буфер O, (50 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) | Оптимальная температура | 37oC | Условия хранения | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 при 25°C); 0.1 mM ZnCl2; 50 mM KCl, 1mM MgCl2; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке | Примечание | Функциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 x SE-буфер O и 0.5 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 37°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli, получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной
ДНК pUC19/HindIII.
Протокол дефосфорилирования 5`-концов ДНК с помощью СIP после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР):
На 20 мкл реакционной смеси:
10 x SE буфер для ЭР или буфер “O” - 2 мкл,
ДНК - 0.5-1 мкг,
деионизованная вода - до 20 мкл.
Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием.
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при оптимальной температуре.
Добавить 0,2-1 мкл (5-20 ед.) щелочной фосфатазы (E328), перемешать пипетированием.
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 37°C.
Очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или путем экстракции фенолом-хлороформом с последующим высаживанием 96%-ным этанолом.
|
| |