Информация по продукту: Щелочная фосфатаза Название Щелочная фосфатаза Кат. номера E328 Фасовки, е.а. 500 Концентрация, е.а./мл 20000 Цена, руб 7500 Источник Выделена из кишечника теленка Описание Щелочная фосфатаза из кишечника телёнка (англ. CIP) катализирует дефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Единица активности За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 1 мл реакционной смеси за 1 мин при 37°C. Реакционная смесь содержала 1M диэтаноламин-HCl (pH 9.8 при 25°C), 0,5 mM MgCl2,10 mM пара-нитрофенилфосфат. Реакционный буфер SE-буфер O, (50 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) Оптимальная температура 37oC Условия хранения 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 при 25°C); 0.1 mM ZnCl2; 50 mM KCl, 1mM MgCl2; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке Примечание Функциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 x SE-буфер O и 0.5 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 37°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli, получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/HindIII. Протокол дефосфорилирования 5`-концов ДНК с помощью СIP после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР): На 20 мкл реакционной смеси: 10 x SE буфер для ЭР или буфер “O” - 2 мкл, ДНК - 0.5-1 мкг, деионизованная вода - до 20 мкл. Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием. Инкубировать в течение 0,5-1 часа при оптимальной температуре. Добавить 0,2-1 мкл (5-20 ед.) щелочной фосфатазы (E328), перемешать пипетированием. Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 37°C. Очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или путем экстракции фенолом-хлороформом с последующим высаживанием 96%-ным этанолом.