Информация по продукту: Термолабильная щелочная фосфатаза


Название
Термолабильная щелочная фосфатаза
Кат. номераE365E366
Фасовки, е.а.2001000
Концентрация, е.а./мл50005000
Цена, руб8503400

ИсточникВыделена из штамма E.coli несущего клонированный ген щелочной фосфатазы из Alteromonas undina P2
ОписаниеТермолабильная щелочная фосфатаза (англ. TAP) катализирует дефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.
Единица активностиЗа единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 0,5 мл реакционной смеси за 15 мин при 16°C. Реакционная смесь содержала 1Х SE-буфер W, 10 mM пара-нитрофенилфосфат.
Реакционный буферSE-буфер W, (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
16oC
Условия хранения20 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°:C); 0.1 mM ZnCl2; 50% глицерин.
Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке
Инактивация 20 мин при
65oC
ПримечаниеФункциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК плазмиды pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1Х SE -буфер W и 1 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 16°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli,получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/Hind III.

Протокол дефосфорилирования 5'-концов ДНК с помощью ТАР после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР):
На 20 мкл реакционной смеси:
10Х SE буфер ЭР (или буфер “W”) - 2 мкл,
ДНК - 0,5-1мкг,
деионизованная вода - до 20 мкл.
Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием.
Инкубировать в течении 0,5-1 часа при оптимальной температуре.
Охладить реакционную смесь во льду в течение 1-2 мин!!!
Добавить 1 мкл (5 ед.) щелочной фосфатазы (Е365/Е366), перемешать пипетированием.
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 16°C(при 25°C активность фермента составляет 75-100%).
Прогреть реакционную смесь при 65°C в течение 20 мин.
Можно использовать обработанную ДНК для дальнейших экспериментов. Если требуется, очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или высадить 96%-ным этанолом.