Информация по продукту: Термолабильная щелочная фосфатаза


Название
Термолабильная щелочная фосфатаза
Кат. номераE365E366
Фасовки, е.а.2001000
Концентрация, е.а./мл50005000
Цена, руб7703080

ИсточникВыделена из штамма E.coli несущего клонированный ген щелочной фосфатазы из Alteromonas undina P2
ОписаниеКатализирует дефосфорилирование 5`- и 3` - концов ДНК и РНК. Так же гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.
Единица активностиЗа единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1μмоля р-нитро-фенилфосфата (PNPP) в 0,5 мл реакционной смеси за 15 мин при 25°C.
При определении единиц активности использовали 10Х SE-буфер W, 50 mM р-нитро-фенилфосфат и препарат фермента.
Реакционный буферSE-буфер W, (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
25oC
Условия хранения20 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°:C); 0.1 mM ZnCl2; 50% глицерин.
Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке
Инактивация 20 мин при
65oC
ПримечаниеФункциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК плазмиды pUC19/HindIII) в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1Х SE -буфер W и 1 мкл фермента, в течение 30 мин при 16°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli,получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/Hind III.

Протокол дефосфорилирования 5'-концов ДНК после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР):
На 20 мкл реакционной смеси:
10Х SE буфер ЭР (или буфер “W”) - 2 мкл,
ДНК - 0,5-1мкг,
деионизованная вода - до 20 мкл.
Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием. Инкубировать в течении 0,5-1 часа при оптимальной температуре. Охладить реакционную смесь во льду в течение 1-2 мин!!!
Если в реакции гидролиза использовался бессолевой буфер “B”, то перед добавлением ТАР рекомендуется добавить в реакционную смесь 2 мкл буфера для щелочной фосфатазы “W”.
Добавить 1 мкл (5 ед.) щелочной фосфатазы (Е365/Е366), перемешать пипетированием. Инкубировать в течении 0,5-1 часа при 16 или 25°C!!! (Инкубация при 37°C приводит к частичной инактивации фермента).
Прогреть реакционную смесь при 65°C в течении 10 мин.
Можно использовать обработанную ДНК для дальнейших экспериментов.