| Сайт узнавания | Последовательность ДНК, содержащая не менее трех 5mC:
GCN↑GC
CG↓NCG
|
| Источник | Planomicrobium koreense 78k |
| Субстратная специфичность | Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
Pkr I расщепляет последовательность ДНК
5`- GCNGC-3`/3`-CGNCG-5',
содержащую не менее трех 5-метилцитозинов (N не учитывается).
Оптимальный субстрат (активность 100%)
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`
5`-G(5mC)NGC-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`
5`-GCNG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`
|
| Субстрат для определения активности | Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три сайта:
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`[2]. |
| Единица активности | За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси (см. рисунок ниже, дор. 4). |
Определение активности PkrI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.
Дорожки:
1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2: 0 мкл Pkr I
3: 0.5 мкл Pkr I
4: 1 мкл Pkr I
5: 2 мкл Pkr I
Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 . |
| Оптимальный SE-буфер | Y (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.) |
| Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: | | B | G | O | W | Y | Rose | | 50 - 75 | 75 - 100 | 10 - 25 | 25 - 50 | 100 | 100 |
|
| Реакционный буфер | SE-буфер Y, (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.) |
| Оптимальная температура | 37oC |
| Условия хранения | 20 mM Tris-HCl (pH 7.4); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке |
| Неспецифический гидролиз | Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 2 ед фермента Pkr I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. |
| Чувствительность к метилированию | Фермент расщепляет только метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1]. |
| Инактивация 20 мин при | 65oC |
| Примечание | С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер Y. |
| Литература: | 1. В.А. Чернухин, Наякшина Т.Н, Гончар Д.А., Томилова Ю.Э., Тарасова М.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярёв С.Х. Новая сайт-специфическая метилзависимая ДНК эндонуклеаза PkrI узнаёт и расщепляет метилированную последовательность 5'-GCN^GC-3'/3'-CG^NCG-5', содержащую не менее 3-х 5-метилцитозинов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 35 - 42
2. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Охапкина С.С., Гончар Д.А., Дедков В.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология, т.41, №1, с. 43-50 (2007)
|