Информация по продукту: Pkr I


Название
Pkr I
Кат. номераE579E580
Фасовки, е.а.50250
Концентрация, е.а./мл10001000
Цена, руб613624544

Сайт узнавания
Последовательность ДНК, содержащая не менее трех 5mC:
GCN↑GC
CG↓NCG
ИсточникPlanomicrobium koreense 78k
Субстратная специфичностьФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].


Pkr I расщепляет последовательность ДНК
5`- GCNGC-3`/3`-CGNCG-5',
содержащую не менее трех 5-метилцитозинов (N не учитывается).

Оптимальный субстрат (активность 100%)
   5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`
   5`-G(5mC)NGC-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`
   5`-GCNG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`
Субстрат для определения активностиСубстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три сайта:
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`[2].
Единица активностиЗа одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси (см. рисунок ниже, дор. 4).
Определение активности PkrI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2: 0 мкл Pkr I
3: 0.5 мкл Pkr I
4: 1 мкл Pkr I
5: 2 мкл Pkr I


Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.

.
Оптимальный SE-буферY (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
BGOWYRose
50 - 7575 - 10010 - 2525 - 50100100
Реакционный буферSE-буфер Y, (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
37oC
Условия хранения20 mM Tris-HCl (pH 7.4); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке
Неспецифический гидролизНе наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 2 ед фермента Pkr I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированиюФермент расщепляет только метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
Инактивация 20 мин при
65oC
ПримечаниеС ферментом поставляется 10 Х SE-буфер Y.
Литература:1. В.А. Чернухин, Наякшина Т.Н, Гончар Д.А., Томилова Ю.Э., Тарасова М.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярёв С.Х. Новая сайт-специфическая метилзависимая ДНК эндонуклеаза PkrI узнаёт и расщепляет метилированную последовательность 5'-GCN^GC-3'/3'-CG^NCG-5', содержащую не менее 3-х 5-метилцитозинов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 35 - 42
2. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Охапкина С.С., Гончар Д.А., Дедков В.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология, т.41, №1, с. 43-50 (2007)