Информация по продукту: Kro I


Название
Kro I
Кат. номераE541E542
Фасовки, е.а.50250
Концентрация, е.а./мл10001000
Цена, руб613624544

Сайт узнавания
G↓C(5mC)GGC
CGG(5mC)C↑G
ИсточникKocurea rosea 307
Субстратная специфичностьФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК
[1] и ДНК, метилированную MspI ДНК-метилтрансферазой.

Сайт узнавания :
5'-G^C(5mC)GGC-3'/ 3'-CGG(5mC)C^G-5`
Субстрат для определения активностиСубстрат pMHpaII1/DriI представляет собой ДНК плазмиды pMHpaII1, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pMHpaII1 содержит ген ДНК-метилтрасферазы M.HpaII, которая модифицирует сайт узнавания 5`-CCGG-3` с образованием
5`-C(5mC)GG-3`/3`-GG(5mC)C-5`,
и три сайта узнавания KroI
5`-GC(5mC)GGC-3`/3`-CGG(5mC)CG-5`.
Единица активностиЗа одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг линейной формы плазмиды pMHpaII1/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Определение активности KroI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHpaII1/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
1 и 6 – 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2 – исходная ДНК , pMHpaII1/DriI
3 – 0.5 мкл Kro I
4 – 1 мкл Kro I
5 – 2 мкл Kro I

Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.
Определение активности KroI на ДНК pMHpaII1/KroI
Оптимальный SE-буферG (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.)
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
BGOWYRose
50 - 7510025 - 5050 - 7575 - 100100
Реакционный буферSE-буфер G, (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
37oC
Условия хранения10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин, 200 мкг/мл BSA. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке
Неспецифический гидролизНе наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Kro I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированиюФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1] и ДНК, метилированную MspI ДНК-метилтрансферазой.
Инактивация 20 мин при
65oC
ПримечаниеС ферментом поставляется 10 Х SE-буфер G.
Литература:1. Чернухин В.А., Журавлева Р.О., Тарасова Г.В., Болтенгаген А.А., Акишев А.Г., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Kocuria rosea - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы KroI. // Патент на изобретение RU 2394099 С1 (2010)
2.
 В.А. Чернухин, Е.В. Килёва, Ю.Э. Томилова, А.А. Болтенгаген, В.С. Дедков, Н.А. Михненкова, Д.А. Гончар, Л.Н. Голикова, С.Х. Дегтярёв Новая метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI узнаёт и расщепляет последовательность ДНК 5'-G^C(5mC)GGC-3' // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 1 – С. 14 - 20