| Сайт узнавания | (5mC)GNNNNN↑NN(5mC)G
G(5mC)NN↓NNNNNG(5mC) |
| Источник | Paracoccus carotinifaciens 3K |
| Субстратная специфичность | Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
Активность фермента зависит от нуклеотидов, фланкирующих сайт узнавания, и количества метилированных цитозинов.
Оптимальный субстрат (активность 100%):
5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'/
3'-WG(5mC)NNNNNNNG(5mC)W-5` |
| Субстрат для определения активности | Плазмида pMHgaI содержит гены
ДНК-метилтрансфераз
M1.HgaI (сайт узнавания 5`-CGCTC-3`)
и M2.HgaI (сайт узнавания
5`-GACGC-3`)
и содержит единственный сайт узнавания PcsI :
5`-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3`
3`-WG(5 m C)NNNNNNNG(5mC)W-5` [1]. |
| Единица активности | За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта
5`-A(5mC)GNNNNNNN(5mC)GT-3`
в 1 мкг ДНК плазмиды pMHgaI/DriI за 1 час при 37°C в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHgaI/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4) и образование двух фрагментов ДНК (см. рисунок ниже, дор. 3-5).
|
Определение активности PcsI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHgaI/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.
Дорожки:
1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2: исходная ДНК , pMHgaI/DriI
3: 0.5 мкл Pcs I
4: 1 мкл Pcs I
5: 2 мкл Pcs I
Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 |
| Оптимальный SE-буфер | SE-буфер PcsI (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C); 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT.) |
| Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: | | B | G | O | W | Y | Rose | | 50 - 75 | 25 - 50 | 0 - 10 | 10 - 25 | 50 - 75 | 20 |
|
| Реакционный буфер | SE-буфер PcsI, (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C); 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT.) |
| Оптимальная температура | 37oC |
| Условия хранения | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин, 100 мкг/мл BSA. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке |
| Неспецифический гидролиз | Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Pcs I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. |
| Чувствительность к метилированию | Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1]. |
| Инактивация 20 мин при | 65oC |
| Примечание | С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер PcsI |
| Литература: | 1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Тарасова Г.В., Голикова Л.Н., Акишев А.Г., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pcs I. // Патент на изобретение RU 2377294 С1 (2009).
|