Информация по продукту: Pcs I


Название
Pcs I
Кат. номераE505E506
Фасовки, е.а.50250
Концентрация, е.а./мл10001000
Цена, руб613628961.92

Сайт узнавания
(5mC)GNNNNN↑NN(5mC)G
G(5mC)NN↓NNNNNG(5mC)
ИсточникParacoccus carotinifaciens 3K
Субстратная специфичностьФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК
[1].

Активность фермента зависит от нуклеотидов, фланкирующих сайт узнавания, и количества метилированных цитозинов.

Оптимальный субстрат (активность 100%):
5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'/ 3'-WG(5mC)NNNNNNNG(5mC)W-5`
Субстрат для определения активностиПлазмида pMHgaI содержит гены ДНК-метилтрансфераз
M1.HgaI (сайт узнавания 5`-CGCTC-3`)
и M2.HgaI (сайт узнавания 5`-GACGC-3`)
и содержит единственный сайт узнавания PcsI :
5`-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3`
3`-WG(5 m C)NNNNNNNG(5mC)W-5` [1].
Единица активностиЗа одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта
5`-A(5mC)GNNNNNNN(5mC)GT-3`
в 1 мкг ДНК плазмиды pMHgaI/DriI за 1 час при 37°C в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHgaI/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4) и образование двух фрагментов ДНК (см. рисунок ниже, дор. 3-5).
Определение активности PcsI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHgaI/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2: исходная ДНК , pMHgaI/DriI
3: 0.5 мкл Pcs I
4: 1 мкл Pcs I
5: 2 мкл Pcs I

Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.

Оптимальный SE-буферSE-буфер PcsI (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C); 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT.)
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
BGOWYRose
50 - 7525 - 500 - 1010 - 2550 - 7520
Реакционный буферSE-буфер PcsI, (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C); 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
37oC
Условия хранения10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин, 100 мкг/мл BSA. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке
Неспецифический гидролизНе наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Pcs I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированиюФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
Инактивация 20 мин при
65oC
ПримечаниеС ферментом поставляется 10 Х SE-буфер PcsI
Литература:1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Тарасова Г.В., Голикова Л.Н., Акишев А.Г., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pcs I. // Патент на изобретение RU 2377294 С1 (2009).