GLAD-ПЦР анализ - новый инструмент для исследования метилирования ДНК

GLAD-ПЦР анализ (GlaI hydrolysis and Ligation Adapter Dependent ПЦР) это новый, не имеющий аналогов метод для изучения метилирования ДНК.

Метод позволяет определять наличие и количество копий сайта 5'-R(5mC)GY-3' в исследуемой точке генома человека или млекопитающих.

На сегодня абберантное метилирование регуляторных областей (промотор и/или первый экзон) генов показано на начальных этапах различных заболеваний таких как онкологические и сердечные заболевания, диабеты и других.

Такое de novo метилирование ДНК осуществляется DNMT3A и DNMT3B ДНК метилтрансферазами. Эти ферменты узнают и метилируют сайт 5’-RCGY-3’ с формированием сайта 5’-R(5mC)GY-3’/3’YG(5mC)R-5’[1]. Недавно открытая сайт-специфическая 5mC-зависимая ДНК эндонуклеаза GlaI распознает именно эту последовательность 5’-R(5mC)^GY-3’/3’YG^(5mC)R-5’ и режет ее как указано символами ^ [2].

GLAD-ПЦР анализ базируется на использовании GlaI и включает 3 простых шага в одной пробирке [3] (см. анимацию процесса ниже):

  1. Гидролиз исследуемой ДНК с помощью GlaI;
  2. лигирование универсального адаптера;
  3. ПЦР в реальнов времени с использованием флюоресцентного зонда.
    НЕ ТРЕБУЕТ БИСУЛЬФИТНОЙ ОБРАБОТКИ ДНК!

Новый метод GLAD-ПЦР анализа используется для определения наличия сайта 5'-R(5mC)GY-3' в заданной точке ДНК в минимальных количествах (6 и более копий) в присутствии избыточного количества неметелированных сайтов. Данная ситуация характерна для клинических образцов ДНК, получаемых, например, из крови.

GLAD-ПЦР анализ ранее был использован для изучения метилирования регуляторных областей генов RARB, CEBPD, ESR1, ELMO1 [4, 6, 10] а также других генов в опухолевых тканях и клеточных линиях. Разработан способ диагностики колоректального рака, получен патент [11].

GLAD-ПЦР анализ разработан для применения в эпигенетических ДНК диагностикумах и проводится в условиях обычной клинической ПЦР лаборатории.

de novo DNA methylation

GLAD-PCR assay stages

Инновационность и преимущества метода

GLAD-ПЦР анализ - уникальная российская разработка. Он превосходит другие методы анализа метилирования по многим параметрам:
  • Простота – 3 простых шага в одной пробирке
  • Требуется только машина для ПЦР в реальном времени
  • Быстрота - всего 3-4 часа
  • Чувствительность – определяет от 6 копий метилированной ДНК в образце
  • Надежность - не более 1% ошибок, высокая повторимость результата

Все эти факторы делают GLAD-ПЦР анализ очень привлекательным для использования в эпигенетической диагностике.

Набор для GLAD-ПЦР анализа

Новый набор был разработан для проведения 200 реакций GLAD-ПЦР на 96-луночных планшетах. В набор включены все реагенты, необходимые для анализа кроме праймеров и флюоресцентных зондов, которые подбираются и синтезируются под исследуемый R(5mC)GY сайт.

Для проведения реакции необходимы:

  • исследуемая ДНК
  • геномный праймер и флюоресцентный зонд, подобранные под исследуемый сайт R(5mC)GY
  • гибридный праймер (состоит из постоянной части комплементарной универсальному адаптеру и четырехнуклеотидной части, комплементарной структуре ДНК в точке гидролиза GlaI).

Набор для GLAD-ПЦР анализа доступен для заказа через наш сайт.

Пожалуйста скачайте инструкцию пользователя для набора для GLAD-ПЦР анализа



Праймеры и флюоресцентные зонды

Для проведения GLAD-ПЦР анализа необходимы флюоресцентный зонд и 2 праймера: геномный и гибридный.

Primers and TaqMan probes Геномный праймер и флюоресцентный зонд располагают поблизости от исследуемого сайта 5’-R(5mC)^GY-3’ и их структура подбирается как обычно [4].

Гибридный праймер имеет структуру 5’-CCTGCTCTTTCATCGGYNN-3’, где 5’-конец 15-нуклеотидного праймера соответствует универсальному адаптеру, а четырехнуклеотидная часть на 3’-конце (подчеркнуто) комплементарна последовательности ДНК в точке гидролиза GlaI. Подобная структура предполагает существование 32 вариантов гибридных праймеров в зависимости от всех возможных вариантов последовательностей концов после гидролиза GlaI в точке NNR(5mC)^GY.

Все праймеры и зонды могут быть заказаны в компании SibEnzyme совместно с набором для GLAD-ПЦР анализа. Вы также можете заказать синтез праймеров и зондов у своего поставщика.

GLAD-ПЦР анализ двух R(5mC)GY сайтов приводится в качестве демонстрации метода.
Смеси праймеров и зондов для анализа этих сайтов включены в набор:

  1. "Контрольная смесь для URB1 (праймеры и флюоресцентный зонд)" предназначена для анализа сайта A(5mC)GT в регуляторной области гена URB1. Сайт расположен в позиции 32334291-32334294 в хромосоме 21 (в соответствии с геномной сборкой GRCh38/hg38).  
  2. "Контрольная смесь для CEBPD (праймеры и флюоресцентный зонд)" предназначена для анализа сайта G(5mC)GC в регуляторной области гена CEBPD. Сайт расположен в позиции 47738502-47738505 в хромосоме 8 (в соответствии с геномной сборкой GRCh38/hg38).

Анимация последовательности GLAD-ПЦР анализа и видео контрольного эксперимента


Представление метода GLAD-ПЦР анализа на научных конференциях:

  1. 43th ISOBM annual congress, сентябрь 2016, Чикаго, США, устная презентация GLAD-PCR assay of DNA methylation markers associated with colorectal cancer
  2. Global Cancer Summit 2015, ноябрь 2015, Бангалор, Индия, устная презентация "GLAD-PCR assay of R(5mC)GY sites in aberrantly methylated regulation regions of tumor-suppression genes in colorectal cancer"
  3. Cancer Epigenomics 2015, Сан-Франциско, США, постерная презентация "Determination of R(5mC)GY sites in regulation regions of tumor-suppression genes by GLAD-PCR assay in colorectal cancer"
  4. Cell Symposia Cancer Epigenomics, Барселона, Искания, октябрь 2013, постерная презентация GLAD PCR analysis of aberrant DNA methylation in cancer

Дополнительные PDF материалы

  1. Methyl-directed DNA Endonucleases
  2. GLAD-PCR assay
  3. GLAD PCR assay Kit
  4. Early Cancer Detection
  5. Determination of R(5mC)GY sites in regulation regions of tumor suppression genes by GLAD-PCR assay in colorectal cancer

Публикации и патенты:

  1. Handa, V., and Jeltsch A. “Profound sequence preference of Dnmt3a and Dnmt3b mammalian DNA methyltransferases shape the human epigenome” // 2005, J. Mol. Biol. 348, 1103-1112
  2. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.Kh. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biology 2008, 9:7
  3. Кузнецов В.В., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК // Патент РФ 2525710 C1
  4. A.G. Akishev, M.A. Abdurashitov, V.L. Sitko, N.A. Netesova, I.F. Radaeva, E.A. Nechaeva, S.Kh. Degtyarev “GLAD-PCR assay of selected R(5mC)GY sites in URB1 and CEPBD genes in human genome” // Res J Pharm Biol Chem Sci, 8(1): pp.465-475, 2017
  5. A.A. Evdokimov , N.A. Netesova , N.A. Smetannikova , M.A. Abdurashitov, A.G. Akishev , B.S. Malyshev , E.S. Davidovich , V.V. Fedotov , V.V. Kuznetsov , Y.D. Ermolaev , A.B. Karpov , A.E. Sazonov , R.M. Tahauov, S.Kh. Degtyarev GLAD-PCR Assay of DNA Methylation Markers Associated with Colorectal Cancer // Biol Med (Aligarh) , 8:7(2016)
  6. А.А.Евдокимов, Н.А.Нетесова, Н.А.Сметанникова, М.А.Абдурашитов, А.Г.Акишев, Е.С.Давидович, В.В. Кузнецов, Ю.Д.Ермолаев, А.Б.Карпов, А.Э.Сазонов, Р.М.Тахауов, С.Х.Дегтярев Применение метода GLAD-ПЦР анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ELMO1 и ESR1 при колоректальном раке // Вопросы онкологии, №1, стр. 116-120 (2016)
  7. А.Г. Акишев, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев  Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 7 , № 3 ,с. 5-16 (2011)
  8. Гончар Д.А., Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 6 , № 1 ,с. 5-12 (2010)
  9. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5'-G(5mC)^GC-3' // Биотехнология, №4, С.31-35 (2006).
  10. A.A. Evdokimov, M.V. Kulak, N.A. Netesova, N.A. Smetannikova, M.A., Abdurashitov, A.G. Akishev, B.S. Malyshev, E.S. Davidovich, V.V. Fedotov, A.B. Karpov, S.Kh. Degtyarev GLAD-PCR Assay of DNA Methylation Markers Associated with Colorectal Cancer // Tumor Biology, Vol.37, supplement 1, Sept. 2016, s6-s7
  11. Дубинин Е.В., Евдокимов А.А., Нетесова Н.А., Сметанникова Н.А., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Давидович Е.С., Дегтярев С.Х., Кузнецов В.В., Михеев В.Н., Карпов А.Б., Малышев Б.С., Федотов В.В. Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLАD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа // Патент РФ, 21.07.2016

 

(©) ООО "СибЭнзайм", 2017